Le 22 décembre 1588, Henri de Guise trouva sous sa serviette un billet qui l’avertissait du danger. Il écrivit au-dessous que le roi n’oserait pas l’attaquer. Le lendemain matin, le duc entra dans le château de Blois pour rejoindre un conseil où, selon le récit de Chateaubriand, des hommes armés attendaient derrière une porte.
Depuis l’ouverture des états à Blois, Henri III et Henri de Guise se disputaient la conduite du royaume. Guise était le chef de la Ligue et avait acquis une puissance que le roi jugeait menaçante. Chateaubriand lui prête plusieurs projets : remettre sa charge de lieutenant-général, obtenir des états l’épée de connétable et s’emparer ensuite des forces du royaume ; ailleurs dans le chapitre, le cardinal de Guise imagine que le roi serait déposé et enfermé tandis que son frère prendrait la couronne. L’auteur reconnaît lui-même que les plans changeaient. Il ne donne pas un programme unique arrêté par toutes les parties, mais montre des ambitions concurrentes autour du trône.
Le roi, de son côté, préparait la mise à mort du duc. Dans un conseil privé, Henri III aurait déclaré qu’il ne pouvait obtenir justice ordinaire contre un homme assez puissant pour faire lui-même le procès de ses juges. Chateaubriand, citant Pasquier, rapporte qu’un ou deux conseillers proposèrent l’emprisonnement et un procès en règle. Les autres estimèrent que, pour un crime de lèse-majesté, le châtiment devait précéder le jugement. Le roi retint cette dernière solution : la décision d’éliminer Guise ne passerait donc pas par une audience.
Chateaubriand décrit une préparation faite par étapes. Henri III feignait de vouloir se retirer du monde et faisait aménager des cellules pour des capucins au-dessus de sa chambre. Il habituait aussi le cardinal de Guise à venir au château pour discuter du maintien du maréchal de Matignon dans sa charge en Guyenne. À ses yeux, ces signes de faiblesse avaient endormi la méfiance de Guise. Dans le même temps, le roi recevait des avertissements sur les desseins prêtés au chef de la Ligue : le duc d’Épernon lui transmettait des lettres et le duc de Mayenne ainsi que le duc d’Aumale faisaient parvenir des nouvelles par des émissaires. La chronique rapporte aussi qu’Henri III invoqua ces avis dans une déclaration publique en février 1589.
La reine-mère, Catherine de Médicis, aurait elle-même demandé à son fils de prendre garde. Le 10 novembre, elle le fit appeler pour lui parler de ce qui touchait à sa vie, à son honneur et à son état. Deux hommes présents dans la pièce seraient restés à distance ; au moment où le roi sortit, ils entendirent Catherine lui recommander de ne pas attendre plus longtemps et de ne pas se laisser surprendre comme il l’avait été lors des barricades de Paris. Le récit place ensuite Guise sur la terrasse du château, agité pendant plus de deux heures après avoir appris cette entrevue.
Le 23 décembre n’était pas le premier jour envisagé pour le meurtre. Les conseillers du roi en avaient repoussé la date, tandis que Guise, averti à plusieurs reprises, hésitait à quitter Blois. Trois jours auparavant, il avait demandé à des proches s’il devait partir pour Orléans. Leurs avis divergeaient : certains l’exhortaient à rester afin de tirer avantage des états, d’autres redoutaient le roi. Chateaubriand rapporte que Mendreville le pressa de se lever en force, puis attribue au duc la réponse qu’il ne fuirait pas, même si la mort entrait par la fenêtre. La veille de l’assassinat, le duc d’Elbeuf le prévint encore ; Guise balaya l’avertissement en faisant allusion aux menaces qu’il avait déjà reçues.
Pendant ce temps, le roi avait fixé le dispositif. Dans la soirée du 22, il fit convoquer des seigneurs, des membres du conseil et quarante-cinq gentilshommes ordinaires. Le capitaine des gardes, Larchant, reçut l’ordre de se placer sur le passage du duc, sous le prétexte de lui présenter une requête concernant les appointements des soldats. Il devait ensuite fermer les accès, avec des hommes placés dans l’escalier et près de la galerie des Cerfs. Les hommes convoqués prendraient ensuite position dans la chambre, le vieux cabinet et les passages, selon les ordres que le roi leur donnerait au matin.
À quatre heures, le 23 décembre, Henri III se leva et enferma Duhalde, puis les gardes qui se présentaient, dans les cellules destinées aux capucins. Les conseillers arrivèrent par un passage étroit et oblique, aménagé à travers la chambre du roi ; l’ancienne porte avait été bouchée. Le roi libéra ensuite ses hommes et les fit revenir en silence, par crainte de réveiller la reine-mère, malade et logée à l’étage inférieur. Il leur parla du danger qu’il attribuait à Guise et leur demanda de le servir. Ils répondirent qu’ils étaient prêts à tuer le duc.
Le maréchal d’Aumont avait d’abord hésité, parce qu’Henri III avait juré réconciliation au duc quelques semaines plus tôt. On le convainquit que Guise avait rompu le premier cet engagement. Le roi choisit alors huit gentilshommes armés de poignards et leur adjoignit Loignac, qui n’avait qu’une épée. D’autres hommes, placés dans le vieux cabinet, devaient frapper le duc à son entrée s’il échappait aux premiers assaillants. L’ordre était de frapper lorsque le duc passerait du conseil au vieux cabinet. Le roi attendit dans un appartement donnant sur les jardins, mais Chateaubriand le décrit incapable de rester en place et préoccupé de l’issue du guet-apens.
Guise dormait encore lorsque ses valets le réveillèrent vers huit heures. On lui dit que le roi allait partir. Sur la terrasse, Lasalle le supplia de ne pas aller plus loin. D’Aubencourt l’avertit à son tour. Le duc poursuivit son chemin. Larchant lui remit alors la requête promise, feignant d’attendre le paiement des gardes qui allaient se retourner contre lui. Au conseil, le duc s’assit devant le feu. Chateaubriand, reprenant Pasquier, rapporte qu’il dit avoir froid et éprouver une douleur au cœur ; quelques gouttes de sang lui seraient sorties du nez. Les observateurs de la scène n’y virent pas un avertissement certain.
Le roi fit appeler Guise dans le vieux cabinet. Nambu, huissier de la chambre chargé de garder le passage, refusa d’abord de laisser entrer le messager, puis le roi lui ordonna d’ouvrir. Le duc se leva, prit son manteau et ses gants, salua les membres du conseil et traversa la chambre où les gardes s’étaient levés pour l’accompagner. Dans le corridor étroit, il se retourna. Montléry l’aîné se jeta alors sur lui et le frappa d’un poignard. D’autres gentilshommes l’atteignirent à leur tour avec leurs armes. Le récit de Chateaubriand rapporte qu’il appelait les assaillants ses amis puis implorait miséricorde ; ces paroles appartiennent aux témoignages anciens dont l’auteur compose sa scène. Malgré les coups, le duc aurait entraîné ses adversaires d’un bout de la pièce à l’autre avant de tomber sur le lit du roi.
Le cardinal de Guise, retenu au conseil, entendit les cris de son frère et voulut se lever. Le maréchal d’Aumont lui ordonna de rester à sa place : le roi avait besoin de lui. Le cardinal et l’archevêque de Lyon furent ensuite arrêtés et enfermés dans les cellules des capucins, puis transférés à la tour de Moulins. Henri III entra voir le duc, déjà mort selon le récit, et lui donna un coup de pied au visage. Chateaubriand rapporte aussi les paroles qu’il aurait prononcées devant le corps.
Le lendemain, 24 décembre, le cardinal de Guise fut tué dans la tour de Moulins par quatre hommes que la chronique dit engagés à prix d’argent. Ce ne fut pas une exécution prononcée par un tribunal, mais le second assassinat d’une opération menée au nom du roi. Après ces deux morts, Henri III fit arrêter plusieurs membres de la famille et des proches du duc, dont la duchesse de Nemours, son fils, le prince de Joinville et l’archevêque de Lyon. D’autres seigneurs de la Ligue s’enfuirent de Blois ; les boutiques fermèrent. Chateaubriand ajoute que les corps furent ensuite détruits et leurs cendres jetées dans le fleuve.
À Blois, le pouvoir royal avait décidé qu’Henri de Guise ne verrait ni procès ni cellule ; le sort de son frère, assassiné le lendemain, prolongea ce choix.